1.  取新生2 d 的Wistar大鼠10 只，無菌條件下取出雙側(cè)視神經(jīng)。

2.  接種至24孔培養(yǎng)板內(nèi)經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。

3.  加入含30g·L-1 小牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，37℃，50mL/L CO2，100%濕度連續(xù)培養(yǎng)3 d 。

4.  3 d 后棄廢液，改為含 5g·L-1 小牛血清DMEM/F12 條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

5.  每周換液2次。在獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量后，改用無血清條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換液一次。

1.  將含細(xì)胞蓋玻片取出，0.01 mol·L-1 PBS沖洗3 次x5 min。

2.  冷丙酮固定10 min。

3.  PBS沖洗(3 次x5 min)。

4.  30g·L-1 過氧化氫室溫孵育15 min。

5.  PBS沖洗3 次x5 min。

6.  滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min。

7.  滴加1:100 GC抗體，陰性對照以PBS代替一抗，37℃孵育60 min。

8.  PBS沖洗3 次x5 min。

9.  滴加 生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37℃，20 min。

10.  PBS沖洗3 次x5 min。

11.  滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液。

12.  DAB工作 液顯色，自來水終止反應(yīng)。

13.  脫水，透明，DPX封片保存。

四、結(jié)果